德国Nordmark品牌的NB胶原酶系列产品提供科研级到GMP级的组织细胞解离方法(下图),同时针对天然胶原酶混合物(包括胶原酶I类和II类,中性蛋白酶和梭状芽胞杆菌),从绵羊体内提取的抗胶原酶多克隆抗体,可识别梭状芽胞杆菌胶原酶的多种亚型,用于ELISA和Western blot等的方法定量分析细胞制剂中残留的胶原酶。

图:胶原酶NB系列产品-从科研级到GMP级组织细胞解离方案

本次小编将分享Nordmark建立的检测胶原酶的基于羊多克隆抗体的双抗夹心ELISA方法,为检测生物制品中的残留胶原酶的质量控制和后续安全的临床治疗打下扎实的基础。

温馨提示:

该双抗夹心ELISA法(包括所用的抗体)适用于定量检测NB - 4标准级胶原酶,NB - 5无菌级胶原酶或NB - 6 GMP级胶原酶产品,使用该protocol以及抗体可检测的胶原酶浓度低至100 ng/ml。

一、 实验准备

· 包被缓冲液:50 mM Na2CO3, 用1 M HCl调节pH 9.6;

· 磷酸盐缓冲液 (PBS):1 X, 用0.1 M NaOH调节pH 7.4;

· 洗涤缓冲液:PBS 含 0.05 % (v/v) Tween 20;

· 封闭液:PBS 含 0.1 % 牛血清白蛋白;

· 底物溶液:将0.2 M Na2HPO4 以及 0.1 M 柠檬酸溶于水,加入0.04 % (w/v) 正交邻苯二胺二盐酸盐,然后用0.1 M NaOH调节pH 5.0。(注意:邻苯二胺二盐酸盐具有光敏性)该底物溶液可在-20°C下保存6个月。

· 过氧化氢溶液:30 % (w/w) (溶剂为水)

· 反应终止液:2 M H2SO4 (溶剂为水)

二、 检测步骤

1、将捕获抗体用包被缓冲液中稀释至10 μg/ml,每孔中加入50 μl (含500 ng 捕获抗体)

2、用盖子盖上微孔板,然后在+2 to +8 °C孵育至少16 h

3、将板子倒过来悬空,在纸巾上轻轻敲出残留的液体。每孔加入300 μl洗涤缓冲液,室温孵育30 s进行洗涤,总共洗三次。最后一步洗完后,在纸巾上轻轻敲出残留的液体

4、每孔加300 μl 封闭液

5、用盖子盖上微孔板,然后在37 ℃孵育至少30 min

6、洗板三次(方法同步骤3)

7、为了制备标准曲线,将胶原酶标准品(三份)用新鲜缓冲液(跟即将冲洗细胞的缓冲液相同)在冰上稀释至1 ng/ml ~ 10 μg/ml,如果没有该缓冲液,则使用洗涤缓冲液(含0.05% (v/v)吐温20的PBS)稀释标准品。将不含胶原酶的缓冲液作为空白,用稀释标准品的缓冲液在冰上稀释检测样本

8、每孔加入上述溶液100 μl

9、将板子盖上盖密封在37℃恒温摇床下以300 rpm 孵育60mins

10、洗板三次(方法同步骤3)

11、将检测抗体在洗涤缓冲液中稀释至5 μg/ml的最终溶液。每孔加50 μl (含250ng检测抗体)

12、将板子盖上盖密封在37℃恒温摇床下以300 rpm 孵育60mins

13、洗板三次(方法同步骤3)

14、每1ml底物溶液加入1 μl H2O2 , 混合后每孔加入100 μl

15、将板子盖好封闭,室温黑暗中孵育20-30分钟

16、每孔加50 μl反应终止液停止反应

17、加入反应终止液后30分钟内用酶标仪在492 nm处测量光密度,绘制标准曲线,定量洗涤细胞的缓冲液中的残留胶原酶

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